DNA-basert sporing for lakseoppdrett

Nr. 1 / Mai 2014

Last ned som PDF Kunnskapsbrevlogo

 

Rømming av oppdrettslaks er en uønsket hendelse som har negative konsekvenser for oppdretterens økonomi og kan føre til genetiske påvirkninger på ville bestander. Med økt fokus på en bærekraftig næring gjennom hele verdikjeden, er innføring av sporingssystemer en viktig del av strategien for å dokumentere opphavet til oppdrettslaks, og samtidig ansvarliggjøre lakseprodusenten.

DNA – laksens identitetCRW_5738_1-m-DNA-2

I laksens arvemateriale eller DNA ligger det en historie som strekker seg tilbake til artens opprinnelse, og som kan gi informasjon om artens unike utviklingshistorie. Siden DNAstrukturen først ble beskrevet av pionerne Watson og Crick i 1953, har vi gradvis lært å tolke DNAkoden. Teknologiutviklingen gjør at vi nå kan innhente stadig mer informasjon fra DNA fra hver enkelt laks, og ikke minst anvende denne informasjonen til ulike praktiske formål. Laksen arver en halvdel av arvematerialet fra hver av foreldrene, og har store deler til felles med sine søsken. Men hvert individ har likevel sin egen unike DNA-variant som gjør det mulig å fastslå slektskapet mellom ulike individer.

DNA for sporing av opprinnelse

Metoden for hvordan DNA kan benyttes som sporingsverktøy ble utviklet innen rettsmedisin allerede på 80-tallet og det er i dag mange eksempler på hvordan genteknologi kan benyttes til å følge biologiske spor. Siden 1992 er all farskapstesting i Norge utelukkende basert på analyse av DNA. Gjennom media er vi alle blitt kjent med betydningen av biologiske spor ved oppklaring av kriminalsaker. Dette sporingssystemet er mulig ved at det er opprettet et register som inneholder DNA-profiler av personer som er domfelt for alvorlige straffbare handlinger. For ikke lenge siden var det en stor matvareskandale i EU etter at DNAtesting avslørte bruk av hestekjøtt i produkter deklarert som storfekjøtt. I et lignende tilfelle ble det avslørt at det var spor av DNA fra gris i halalkjøtt servert i britiske fengsler, med mange påfølgende medieoppslag. DNA benyttes allerede til å verifisere korrekt merking om art, opprinnelse og produksjonsland. Dette får stadig større betydning på den globale markedsplassen. Spesielt for matprodusenter har det stor verdi å kunne vise ansvarlig opptreden på alle stadier av verdikjeden, og sporbarhet er en forutsetning for en troverdig strategi knyttet til mattrygghet og bærekraft.

Hva kan laksens DNA avsløre?

I Norge er det over 400 elver med lokale laksestammer, og laksen vil i stor grad returnere til hjemmeelven for å gyte. Denne nedarvede adferden gjør at ulike laksestammer skiller seg genetisk fra hverandre, og DNA-sporing kan brukes til å bestemme den genetiske opprinnelsen og dermed stammetilhørighet til en villaks. DNA-markører er lenge blitt benyttet i forvaltningen av stillehavslaks for å regulere fisket av spesielt sårbare stammer. Langs kysten av Vest-Grønland samles laks av ulik opprinnelse, både canadisk og europeisk atlantisk laks, og bruk av DNA-analyser er regulert i et transatlantisk samarbeid for å vite hvilke bestander som beskattes ved fiske i denne regionen. Tilsvarende benyttes DNA-analyser for å overvåke utviklingen i ulike bestander av baltisk laks. Også her til lands er det forventet at DNA-analyser vil bli et viktig verktøy for villaksforvaltningen. En forskergruppe med deltakere fra Nofima, NINA, CIGENE og AquaGen publiserte i 2011 et arbeid som viser at en med et panel på 60 genmarkører med stor sikkerhet kan skille oppdrettslaks fra villaks. I prosjektet Quant Escape ønsker NINA med partnere å karakterisere og kvantifisere genstrømmen fra rømt oppdrettslaks til villaks, blant annet gjennom bruk av kraftige genotypingsverktøy utviklet av forskere hos AquaGen og CIGENE. Dette blir en viktig kunnskapsplattform for å følge den genetiske identiteten til villaksen inn i fremtiden.

Figur 1. Illustrasjonen viser en definert del av DNA-tråden fra to ulike fisk. Bokstavene angir de fire basene, A (Adenin), C (Cytosin), G (Guanin) og T (Thymin) som er en del av nukleotidene som DNA-tråden er bygd opp av. Rekkefølgen og hvilke baser som finnes på spesifikke punkter er avgjørende for hvilke type proteiner det kodes for og hvilke funksjoner disse får i fisken. Dette kan igjen bidra til forskjeller i egenskaper hos fisk. DNA-analyser som avdekker variasjoner i basene kan gjøres ved bruk av SNP (single nucleotid polymorphism)- genmarkører og/eller mikrosatelittgenmarkører.

Figur 1. Illustrasjonen viser en definert del av DNA-tråden fra to ulike fisk. Bokstavene angir de fire basene, A (Adenin), C (Cytosin), G (Guanin) og T (Thymin) som er en del av nukleotidene som DNA-tråden er bygd opp av. Rekkefølgen og hvilke baser som finnes på spesifikke punkter er avgjørende for hvilke type proteiner det kodes for og hvilke funksjoner disse får i fisken. Dette kan igjen bidra til forskjeller i egenskaper hos fisk. DNA-analyser som avdekker variasjoner i basene kan gjøres ved bruk av SNP (single nucleotid polymorphism)- genmarkører og/eller mikrosatelittgenmarkører.

På østkysten av Canada og USA er DNA-sporing av oppdrettslaks allerede implementert. Canadiske og amerikanske myndigheter pålegger avlsselskapene å lagre DNA-profiler fra alle foreldrefisk som benyttes til å produsere rogn. Dette muliggjør identifisering og sporing av rømt fisk tilbake til ansvarlig selskap. I Norge er det igangsatt en rekke studier, finansiert av Fiskeri- og havbruksnæringens forskningsfond, som blant annet har evaluert og optimalisert metoder til bruk innen DNA-sporing av rømt oppdrettslaks. Studiene har demonstrert at ved å kombinere DNA-analyser av foreldrefisk med styring av unike rognbatcher fra rognprodusent til settefisk og matfiskanlegg gir en sikker sporing av rømt oppdrettsfisk.

Genotypingsverktøy for atlantisk laks

Tradisjonelt har det vært benyttet såkalte mikrosatelittbaserte genmarkører til å analysere laksens DNA, både innen avlsarbeid og til sporingsformål. I de senere år er det utviklet en ny metode, såkalte SNP-analyser, som er mer nøyaktig og er enklere å gjennomføre på store mengder prøver (se Figur 1 som illustrerer forskjellen mellom SNP- og mikrosatelittmarkører). Den store fordelen med bruk av såkalte SNP- paneler eller SNP-chip, er at et stort antall markører kan testes samtidig, gjerne flere ti- eller hundretusener av markører i samme analyse. For utenom humanmedisinske formål har denne teknologien så langt hatt begrenset anvendelse, fordi hver analyse har vært kostbar. Nå er imidlertid kostnadene betydelig redusert, og etablering av en DNA-basert databank av all stamfisk som produserer rogn for oppdrettsnæringen i Norge er mulig å gjennomføre til en akseptabel kostnad.

Hvordan kan det gjøres?

Figur 2. DNA-sporing av foreldrene til hver enkelt rognleveranse utføres ved at vevsprøver av alle hunn- og hannfiskene blir tatt ved befruktningstidspunktet. Vevsprøvene registreres elektronisk slik at resultater fra genotypingen kan spores tilbake til riktig rognleveranse og oppdretter i etterkant.

Figur 2. DNA-sporing av foreldrene til hver enkelt rognleveranse utføres ved at vevsprøver av alle hunn- og hannfiskene blir tatt ved befruktningstidspunktet. Vevsprøvene registreres elektronisk slik at resultater fra genotypingen kan spores tilbake til riktig rognleveranse og oppdretter i etterkant.

Rognprodusentene kan enkelt ta en vevsprøve av hver stamfisk ved stryking (Figur 2). Her er det bare å følge allerede etablerte rutiner da mye av fisken allerede genotypes for andre genmarkører i såkalt QTL-basert seleksjon. En må videre holde strenge rutiner for elektronisk sporing av både stamfisk og rogn, og det må være klar separasjon mellom hver rognbatch for å hindre at rogn fra de samme foreldrepar sendes til fler enn ett settefiskanlegg. Dette vil medføre noe redusert fleksibilitet i rognproduksjonen og en må legge inn større bufferkapasitet, men innenfor det som kan håndteres, og uten at det fører til uforholdsmessig kostnadsøkning. Vevsprøvene sendes til et laboratorium for DNA-rensing, og videre til genotyping. Genotypings-resultatene fra mor og far sendes til en database for videre lagring. Ved en rømmingsepisode vil rømt fisk genotypes og sjekkes mot denne databasen. Om mor og far ligger i databasen vil opprinnelsen til rømlingen identifiseres med 100 % sikkerhet. Alternativt kan man avkrefte om en mistenkt rømt fisk kommer fra et spesielt anlegg dersom anlegget har fisk hvor foreldrene er genotypet og lagt inn i dataregisteret. For å oppnå tilnærmet 100 % sikkerhet i analysene kreves at laksen analyseres for minimum 1 000 genmarkører. Hvis antallet økes opp til 10 000, har en svært høy sikkerhet og kan analysere fisk med nært slektskap og med et stort antall mulige foreldre i databasen.

Høytetthets genmarkørsett tatt i bruk

AquaGen og CIGENE har samarbeidet om utviklingen av to høytetthets SNP-paneler for laks. Arbeidet er basert på full-genomsekvensering av nærmere 30 laks. Dette resulterte i identifisering av mer enn 5 millioner SNP-markører, hvorav et utvalg av 930 000 markører ble brukt i det første SNP-panelet (930k). Omkring 1000 fisk er genotypet for 930 000 SNP’er, og de 220 000 SNP’er som gav mest informasjon ble brukt til det andre SNP-panelet (220k). Dette er igjen benyttet til genotyping av nærmere 7 000 laks, hvorav 1 000 villaks fra Quant Escape-prosjektet er inkludert. Flere avlsselskaper for både husdyr og planter finner at et SNP-panel på omkring 50 000 SNP’er gir en ideell mengde informasjon i forhold til kostnadene knyttet til genotyping. CIGENE oppgraderer nå sin instrumentpark for å kunne kjøre et større antall prøver på kortere tid. AquaGen vil samle 50 000 av de beste SNP-markørene til bruk i avlsarbeidet. AquaGen har brukt mye tid og ressurser på å utvikle gode genotypingsverktøy, og vil kunne utvikle et spesialdesignet sporingspanel som inneholder 10 000 SNP’er. Denne vil tilgjengeliggjøres slik at også stamfisk fra andre avlsprogrammer kan genotyperes på plattformen og inkluderes i databasen, samt være et svært viktig verktøy for studier av villaks generelt og spesielt interaksjoner mellom oppdrettslaks og villaks (Figur 3).

Figur 3. DNA fra en potensiell rømt oppdrettslaks kan genotypes og sjekkes opp mot databasen for oppdrettslaksforeldre. Hvis DNA-analysen viser en positiv kobling mellom laksen og foreldre i registeret, kan spesifikk informasjon om rognleveransen spores tilbake til riktig settefiskanlegg med 100 % sikkerhet. Analysen kan også alternativt avdekke om laksen har tilhørighet til ulike villaksstammer eller blandingsstammer mellom villaks og oppdrettslaks.

Figur 3. DNA fra en potensiell rømt oppdrettslaks kan genotypes og sjekkes opp mot databasen for oppdrettslaksforeldre. Hvis DNA-analysen viser en positiv kobling mellom laksen og foreldre i registeret, kan spesifikk informasjon om rognleveransen spores tilbake til riktig settefiskanlegg med 100 % sikkerhet. Analysen kan også alternativt avdekke om laksen har tilhørighet til ulike villaksstammer eller blandingsstammer mellom villaks og oppdrettslaks.

 

Genotyping, drifting av database og tilordning av rømt fisk kan gjøres av CIGENE, med melding tilbake til avlsselskapet som har ansvar for å spore leveransen videre sammen med oppdretter. Da vi i dag har en stadig større andel integrerte selskap, vil en i de fleste tilfeller kunne peke direkte på ansvarlig selskap. Når det gjelder frittstående smoltprodusenter, kan sporingen være mer utfordrende til ansvarlig selskap, men her kan produksjonen også tilrettelegges slik at hver smoltkunde får fisk fra separate rognpartier.

Hvor raskt kan det implementeres?

De tre nordnorske oppdretterne Cermaq, Nordlaks og Nova Sea tar i bruk sporingen for alle rognpartier som leveres fra oktober 2014. Deretter kan rømmingsepisoder i selskapenes produksjonsområder alltid sjekkes opp mot foreldredatabasen, og involvering bekreftes eller avkreftes. Undersøkelsen vil også avdekke eventuell villfisk som feilaktig mistenkes for å være oppdrettsfisk. Ordningen kan enkelt utvides dersom andre oppdrettere eller avlsselskap vil innføre genetisk sporing, og videre til etablering av en nasjonal plattform. AquaGen stiller genotypingsverktøyet (10 000 SNP’er) tilgjengelig for sporingsformål. CIGENE utfører genotyping, drifter databasen og tilordner til stamfiskforeldre som en uavhengig tredjepart. Avlsselskapene eier selv resultatene for genotyping av egen stamme, men stiller resultatene tilgjengelig for sporingsformål.

DNA-sporing gir sikkert svar

Den største fordelen med DNA-sporing er at den bygger på en grunnteknologi som er utviklet, optimalisert, validert og tatt i bruk til ulike samfunnsnyttige formål gjennom de sist 20 årene. Metoden har oppnådd høy grad av troverdighet og allmenn aksept både i rettssystemet og i samfunnet generelt. Å ta denne metoden i bruk til sporing av rømt oppdrettsfisk innebærer ingen fysisk merking som påfører fisken smerte eller ubehag. Den innebærer ingen ekstra sortering eller håndtering av fisken, heller ingen spesialdietter. Merkingen er også svært sikker da den ikke kan falle av eller endres i løpet av fiskens levetid. Kostnadene er lave sammenlignet med andre alternativer, i og med at de tas på stamfisk- og rognleddet. På nasjonalt nivå vil det si at kostnader for genotyping og drifting av database for et årlig antall av omkring 50 000 stamfisk skal fordeles på 350 millioner rogn produsert. I tillegg kommer kostnader knyttet til tilpassing av produksjonen både på rogn, settefisk- og matfiskleddet, men dette er fremdeles lave sammenlignet med mange av de andre alternativene som er foreslått. DNA-sporing benyttes allerede i dag i et begrenset omfang innen forskning og kartlegging av villfiskstammer. Metoden kan sikkert og effektivt skille oppdrettslaks fra villaks og også skille mellom ulike villaksstammer. Ved å utvide bruken av metoden til å omfatte sporing av rømt oppdrettslaks, vil man samtidig kunne bygge opp faktagrunnlag knyttet til helt sentrale problemstillinger innen villaksforvaltingen som f.eks. omfanget av feilvandring av ulike villaksstammer og innslag av hybrider mellom oppdrettslaks og villaks.

Kombinasjon av flere metoder gir trolig det beste resultatet

Alle potensielle sporingsmetoder som vurderes har sine svakheter og ulemper. Det kan derfor være hensiktsmessig å benytte en kombinasjon av metoder, som for eksempel DNA-sporing sammen med mineralanalyse av fiskeskjell. Disse to tilnærminger er på mange måter komplementære, og kan supplere hverandre hvis det skulle dukke opp tvilstilfeller.

DNA-metoden kan tas i bruk umiddelbart og vil gi en sikker sporing tilbake til settefiskanlegg. I tilfeller med blanding av smoltgrupper i settefiskanlegget, eventuelt distribusjon av samme smoltgruppe til flere matfiskanlegg vil DNA- sporing begrense antall mulige matfiskkilder til en rømming til et fåtall anlegg. Mineralelementmetoden kan potensielt gi mer spesifikk informasjon som reflekterer vannkilden i ferskvann og sjøvann.

Fakta om genmarkører

En SNP (single nucleotid polymorphism)- genmarkør avdekker en enkelt base på et spesifikt punkt på DNA-tråden. Ved å benytte mange ulike SNP’er spredt utover genomet samtidig, får vi en høy sikkerhet for å bestemme de genetiske egenskapene
En mikrosatelitt-genmarkør finner områder med mange sammenhengende repeterende baser på DNA-tråden. De nærliggende basene rundt mikrosatelitten vil som regel også følge med ved reproduksjon, og det er funnet viktige gentiske egenskaper i tilknytning til slike mikrosatelitter. Denne markørtypen er mye brukt i slektskapstester, men SNP-analyser har blitt mer aktuelle på grunn av økt presisjon, effektivitet og lavere kostnader i forhold til mikrosatelittanalyser.